PROJEKTY EPS biotechnology

Projekt Vývoj sektových a hybridních vinařských kvasinek (NewSec) reflektuje na zvyšující se poptávku v enologické společnosti po sofistikovaných kvasinkových preparátech, které výrobku přinášejí přidanou hodnotu. Jednak je to využití autochtonních mikroorganismů a podpoření autentičnosti produktu (sektové kvasinky) a dále pak aplikovat nově vyšlechtěné hybridní kvasinky, které přináší řadu technologických výhod.

Náplň projektu je rozdělena do dvou podprojektových linií, jejichž společným jmenovatelem je skutečnost, že se jedná o kvasinkové preparáty určené pro enologickou aplikaci. Jsou to sektové kvasinky, které jsou určeny pro sekundární fermentaci v procesu výroby šumivých vín. V průběhu projektu bude připravena technologie selekce, charakterizace, kultivace a aplikace sektových kvasinek.

Druhá podprojektová linie řeší vývoj nových hybridních kvasinek vzniklých tzv. konvenčními metodami (nevznikne GMO). Při vývoji a selekci těchto kvasinek bude kladen důraz na vybrané fenotypové vlastnosti (obecně modulace senzorického projevu kvasinek - vyšší schopnost volatilizace monoterpenoidů, vyšší esterázová aktivita atd.). V rámci této linie vznikne technologický popis výběru vstupních kmenů, proces hybridizace a ověření jeho účinnosti, charakterizace hybridní populace, kultivace a jejich aplikace.

Projektové konsorcium tvoří společnost EPS biotechnology, s.r.o., která je etablovaným subjektem v oblasti vývoje a komercionalizace enologických preparátů. Partnerem z produkční sféry je Víno Hruška s.r.o., který se bude přímo podílet na vývoji za využití svých výrobních kapacit. Formou externí spolupráce je počítáno s dalším produkčním subjektem – Víno J. Stávek.

Aktivita I – EPS sektové kvasinky

Jednou z odnoží projektu NEWSEC je výroba sektů a s tím souvisí vývoj sektových kvasinek pro účely EPS biotechnology. Hlavním cílem první etapy (aktivita I) grantového projektu bylo vytvoření materiálové a know-how základny, která posloužila při komplexním procesu výroby sektů.

V úvodu první etapy byla vytvořena rešerše, která se obsáhle věnovala problematice výrobě šumivých vín, přípravě zákvasů či průběhu sekundární fermentace. Následně bylo na základě míry ethanolové tolerance vybráno ze sbírky EPS biotechnology 8 saccharomycetních izolátů, které byly podrobeny detailní charakterizací jejich technologických vlastností. Cílem těchto charakterizací bylo získání relevantních informací o rychlosti adaptace kvasinek na vybranou škálu etanolu, zjistit jejich toleranci vůči SO2 či tendenci produkce H2S. Na základě tohoto laboratorního testování bylo vybráno 5 sbírkových izolátů. Tyto izoláty byly spolu s komerčně zakoupenou sektovou kvasinkou podrobeny sekundární fermentaci v laboratorním měřítku, která měla za cíl simulovat reálné podmínky při výrobě sektů (míra produkce CO2, sledování tvorby defektních senzorických látek). Na základě výsledků sekundární fermentace byly vybrány dva izoláty, které byly nakultivovány v bioreaktorech v CVMB a použity na přípravu experimentální šarže v technologickém sklepě CVMB a také u projektového partnera Víno Hruška a externího partnera J. Stávka. V rámci experimentální šarže byla na vybraných kvasinkových izolátech provedena klasická technologie sekundární fermentace v lahvi ale i sekundární kvašení v přetlakové nádobě.

Aktivita II – Autochtonní sektové kvasinky

Druhá aktivita grantového projektu se zabývala vývojem sektových autochtonních kvasinek pro Víno Hruška a J. Stávka. Autochtonní kvasinky byly izolovány z konkrétní lokality ve vinohradu a to zpracováním hroznů (lisování hroznů, zisk moštu), následnou fermentací v laboratoři a izolací dominantních saccharomycetních kvasinek při 10 %. obj. ethanolu. Takto získané autochtonní izoláty byly podrobeny laboratornímu testování, přičemž důraz byl opětovně kladen na míru ethanolové tolerance a produkce H2S. Na základě tohoto výsledku bylo vybráno celkem 5 kvasinek (3 autochtonní pro projektového partnera Víno Hruška, 2 autochtonní pro externího partnera J. Stávka), které byly podrobeny laboratorní sekundární fermentaci, na základě čehož došlo k eliminaci nevhodných izolátů.

Aktivita III – Hybridní kvasinky pro výrobu tichého vína

Třetí aktivita se věnuje vývoji hybridních kvasinek pro účely výroby tichých vín s cílem posílení vybraných vlastností saccharomycetních kvasinek. Využití těchto kvasinek spočívá v tvorbě nových znaků ve víně v důsledku rozšíření metabolického repertoáru kmene, jakož i ve schopnosti provádět fermentaci za nestandardních podmínek. Hybridy mohou vzniknout pářením dvou geneticky odlišných kmenů téhož druhu a tyto kmeny se nazývají vnitrodruhové hybridy (intraspecifické). Druhá třída hybridů se nazývá mezidruhové hybridy (interspecifické) a vznikají pářením dvou různých druhů nebo rodů. Prvním krokem dané aktivity byl výběr výchozích parentálních kvasinek ze sbírky EPS biotechnology, s.r.o. na základě již dostupných informací o daných izolátech. K zajištění izolace hybridní kvasinky z populace parentálních kvasinek bylo potřeba před samotnou hybridizací vyselektovat parentální kmeny, které nejsou schopny růst na určitých typech půd. Prototrofní hybridní kmeny tedy byly izolovány z populace auxotrofních rodičovských kmenů při pěstování na minimálním médiu. Z vybraných rodičovských kmenů se podařilo vyselektovat tři lysinové auxotrofní kmeny, jejichž haploidní buňky získané ze spor byly použity k následné hybridizaci. Úspěšnou metodou hybridizace byla metoda mass mating – pohlavní páření, pomocí které byly vytvořeny dva kvasinkové kmeny s hybridním statusem (jeden intraspecifický hybrid Saccharomyces cerevisiae a jeden interspecifický hybrid S.cerevisiae a S. bayanus). Hybridní stav byl potvrzen pomocí PCR metod interdelta-PCR a PCR s využitím druhovo specifických primerů. Hybridní kvasinky byly podrobeny základní technologické charakterizaci a fermentačním testům na syntetickém médiu. Následně byl vybrán jeden kmen – experimentální šarže I pro testování v reálných podmínkách u projektového partnera Víno Hruška a v experimentálním sklepě EPS biotechnology, s.r.o. Při aplikaci hybridního kmene s parentálním a komerčním kmenem se ukázalo, že při kvašení moštu odrody Ryzlink rýnský hybridní kvasinka podpořila odrůdovost a zvýšila ovocno-květnaté aroma vína. V další etapě bude probíhat detailnější charakterizace vytvořených hybridních kvasinek a následné testování experimentální šarže II.

Aktivita I

Jednou z větví projektu NEWSEC je výroba sektů a s tím související vývoj sektových kvasinek pro účely EPS biotechnology s.r.o. V návaznosti na první etapu, kde byl proveden výběr, izolace a charakterizace technologicky významných mikroorganismů, byla druhá etapa věnována finální selekci sektových kvasinek a jejich schopnosti provést sekundární kvašení v reálných podmínkách při výrobě šumivého vína.

Bylo provedeno druhé kolo senzorických analýz šumivých vín získaných v první etapě projektu, s následnou kritickou analýzou dosažených výstupů a selekcí izolátů vhodných pro výrobu tohoto typu nápoje. Založena byla experimentální šarže II s úzkým výběrem selektovaných kvasinek a s minimální dobou zrání sektů na kalech (9 měsíců dle legislativy). Testován byl i přídavek různých konvenčně dostupných setřásacích přípravků, dávkování kvasinek a vliv použité dávky asimilovatelného dusíku na zjištění produkce sulfanu.

Výsledkem řešení grantového projektu jsou dva preparáty sektových kvasinek – EPS1108 a EPS1214 (pro účely EPS biotechnology s.r.o), které disponují vysokým potenciálem komercionalizace. Prostřednictvím izolátu EPS1108 lze vyrobit ovocná a mírně krémová šumivá vína, zatímco u sektů kvašených kvasinkou EPS1214 je přítomna hlavně krémovost. Významným výstupem je také optimalizovaný zákvasový protokol, který umožňuje připravit zákvas sektových kvasinek v nadstandardní kvalitě s vysokým podílem adaptovaných buněk schopných tolerovat nepříznivé podmínky základního vína.

Aktivita II

Druhá aktivita grantového projektu se zabývala vývojem sektových autochtonních kvasinek pro Víno Hruška s.r.o. a Víno J. Stávek. Autochtonní izoláty, které byly vybrány v první etapě projektu byly ve druhé etapě nakultivovány v CVMB a použity pro vytvoření experimentální šarže I. Místem realizace byl majoritně technologický sklep projektových partnerů. Výsledkem této aktivity byl zisk tří izolátů pro účely Víno Hruška s.r.o. a dvou kvasinek pro účely Víno J. Stávek.

Degustace sektů (sekundární kvašení pomocí sektových kvasinek z vinic Víno Hruška) prokázala mírné odlišnosti mezi jednotlivými izoláty a délkou zrání vína na kalech. Všechny sekty vyrobené autochtonními izoláty byly nezávislými degustátory bodově lépe hodnoceny než sekty vyrobené komerčními sektovými kvasinkami.

Mimo jiné byl ve spolupráci s projektovým partnerem Víno J. Stávek jednoznačně prokázán pozitivní vliv použité autochtonní kvasinky na aromatický profil výsledného produktu. Senzorická analýza poukázala na příznivější organoleptické vlastnosti šumivých vín, pokud byla k jejich fermentaci použita autochtonní kvasinka izolována z příslušné odrůdy. V případě šumivého vína odrůdy Chardonnay byla lépe hodnocena kvasinka, která měla původ ze stejné odrůdy. Ve vůni dominovaly tóny žlutého ovoce, vanilky a sušenek, zatímco chuť byla plná a kulatá. Podobný trend odrůdovosti byl sledován i při sektech vyrobených z Frankovky, kde byla lépe hodnocena kvasinka, která byla získána z dané odrůdy. Výsledné šumivé víno bylo šťavnaté s výrazným jahodovým aroma.

Aktivita III

V návaznosti na 1. etapu projektu probíhala detailnější charakterizace již vytvořených hybridních kvasinek. Byly stanoveny β-lyasové a β-glukosidasové aktivity (predikce k uvolňování vázaných thiolů a terpenů), dále byla stanovena produkce H2S a SO2, tolerance vůči volnému SO2 a náročnost kvasinek na zdroj asimilovatelného dusíku. Byly provedeny fermentační testy pro zjištění produkce ethanolu, dynamiky průběhu fermentace a případného odhalení defektu v průběhu fermentace.

Pro rozšíření repertoáru hybridních kvasinek byli pomocí již dostupných metod vytvořeni mezidruhoví hybridi, kteří vznikají pářením dvou různých druhů nebo rodů (v našem případě S. cerevisiae a S. bayanus). Pomocí UV záření byli vyselektováni adeninoví auxotrofní jedinci, u kterých dochází k porušení genů ade1 a ade2 a tím hromadí ve svých buňkách intermediáty syntézy adeninu, které se složkami cytoplazmy tvoří červené barvivo. Adeninový jedinci byli následně využiti pro hybridizaci mezi již vytvořenými lysinovými auxotrofy za vzniku vnitrodruhových hybridů.

Po úspěšné hybridizaci a potvrzení hybridního stavu pomocí molekulárně biologických metod proběhla u kvasinek fenotypová charakterizace. Po vyhodnocení dosažených výsledků došlo k eliminaci nevhodných izolátů. Vyselektované hybridní kvasinky EPS1320, EPS1363 a EPS1364 (mezidruhoví hybridi – S. cerevisiae x S. bayanus) byly využity pro přípravu experimentální šarže II u projektového partnera Víno Hruška s.r.o. a v experimentálním sklepě EPS biotechnology s.r.o. a další hybridní kvasinky EPS1436, EPS1439, EPS1441 a EPS1444 (vnitrodruhoví hybridi – S. cerevisiae x S. cerevisiae) byly testovány v laboratorním měřítku na pasterovaném moštu.

Testování v reálných podmínkách probíhalo celkem na třech různých odrůdách (Tramín červený – experimentální sklep EPS biotechnology s.r.o.; Chardonnay – Víno Hruška s.r.o.; Zweigeltrebe a Cabernet Moravia rosé – Víno Hruška s.r.o.). Byly vytvořeny tři šarže Tramínu červeného, kde víno fermentované s kvasinkou EPS1363 spadá do kategorie polosladkých vín a ostatní dvě šarže do sladkých vín. Aroma vín bylo odrůdové, kdy víno kvašené kvasinkou EPS1320 bylo hodnoceno nejlépe. Výsledná bílá vína u projektového partnera byla hodnocena pozitivně s květinovo-bylinným aroma a tóny hrušky. Růžové víno bylo lehce ovocné a v chuti vystupovaly mléčné tóny. Nově vytvořené hybridní kvasinky EPS1436, EPS1439, EPS1441 a EPS1444 byly testovány na pasterovaném moštu Muškátu moravského v laboratorním měřítku. Výsledná vína byla hodnocena pozitivně bez vad. Víno prokvašené kvasinkou EPS1441 bylo hodnoceno nejlépe a bylo podpořeno květnaté aroma, v chuti dominovala zralá meruňka. Víno bylo svěží s vysokou perzistencí. Na základě získaných dat vnitrodruhoví hybridi projevili vysoký potenciál pro další využití.